针对NIR-II 有机小分子荧光探针的相关性质及存在的问题, 本综述以近年来NIR-II 有机小分子荧光探针的发展为主体, 概括了提升探针荧光量子产率的策略,分别就可激活型、多模态成像型和诊疗一体化型NIR-II探针进行分类讨论, 系统介绍了近年来该领域内的研究成果, 并针对NIR-II 荧光探针未来的发展进行了展望,以期为国内外相关领域的发展提供思路.
2 新型NIR-II 有机小分子荧光探针分子结构设计
2.1 苯并双噻二唑(BBTD)类
由供电子基团(D)和受电子基团(A)构筑的D-A-D结构是获得有机小分子NIR-II 荧光探针最有效的方法之一. BBTD 作为一种强吸电子基团被广泛应用于构筑D-A-D型有机小分子NIR-II荧光探针. 2016 年, 洪学传、戴宏杰及程震等[ 1 0 ]报道了首例以该基团为核心的NIR-II 有机小分子CH1055(图2a), 分子中BBTD 与两侧的强给电子基团三苯胺(TPA)组成典型的D-A-D结构,进一步用聚乙二醇( P E G ) 修饰, 得到水溶性CH1055-PEG. 其荧光发射最高峰为1055 nm, 且峰尾可延伸至NIR-IIa 区域, 荧光量子产率为0.3%. 与吲哚菁绿(ICG)相比, CH1055-PEG 在小鼠血管、前哨淋巴结及活体深度肿瘤成像方面均表现出较好的成像效果. 值得注意的是, CH1055-PEG 具有较好的肾脏排泄能力(24 h内可通过肾脏排泄大约90%). 利用该探针优异的光学性质, 研究者首次成功实现了NIR-II 荧光成像精准指导下的小鼠皮下肿瘤切除手术, 展示出优异的临床应用潜力. 随后, 他们将CH1055 进行磺酸修饰得到水溶性CH-4T(图2a), 并进一步与血浆蛋白络合形成超分子复合物[11]. 与CH-4T 相比, 形成的超分子复合物荧光强度大大提升(图2b), 其荧光量子产率高达5%, 成功实现了活体深度肿瘤和血管的快速清晰成像, 进一步推动了有机小分子NIR-II 荧光探针在临床上的应用研究. 此外,戴宏杰、程震及Hsueh 等[12]构筑了一例卵泡刺激素(FSH)修饰的CH1055 衍生物FSH-CH(图2a), 并成功实现了成年雌性小鼠卵泡及成年雄性小鼠睾丸生精小管的精准靶向NIR-II 荧光成像(图2c). 基于CH1055 骨架,孙耀和杨光富等[13]利用聚乙二醇化策略, 即在骨架上修饰不同长度的聚乙二醇链, 制备了一系列具有不同尺寸的荧光探针. 根据不同尺寸探针所具有的独特性质,成功实现了淋巴系统的精准追踪、小鼠脑血管网络的精准识别及成像指导的肿瘤手术精准切除, 并首次实现了肝纤维化疾病的早期精准诊断, 为NIR-II 荧光技术应用开辟了新的领域. 最近, 喻爱喜课题组[14]将CH1055 与Ⅱ型胶原蛋白靶向多肽WYRGRL 相结合设计合成了新型NIR-II 荧光探针CH1055-WL, 成功应用于小鼠关节软骨的降解成像, 该研究对骨关节炎的早期精准诊断具有重要意义.
图2
为了进一步考察分子结构对光学性质的影响, 程震和洪学传等[15]设计合成了具有不同供体及受体单元的D-A-D 型小分子探针Q1～Q4(图3a), 光谱结果表明Q4分子具有最佳的光学性能(图3b 及3c). 与CH1055 相比较, 由于电富性噻吩的引入, Q4 分子表现出更小的能隙, 其最大荧光发射峰为1100 nm. 进一步利用纳米沉淀法制备Q4 NPs 并实现活体肿瘤血管的高分辨成像.此外, 首次通过小分子多肽RM26 的修饰获得具有靶向能力的SCH1100 探针, 对PC3 型肿瘤表现出优异的富集及成像效果, 极大地丰富了有机小分子NIR-II 荧光探针的分子结构及功能应用. 随后, 洪学传课题组[16]对Q4 分子进一步优化, 其用2-氨基-9,9-二烷基芴取代三苯胺得到新型NIR-II 小分子H1(图 3d). 芴单元的引入不仅可以起到调控分子电子分布及能带的效果, 而且可以减少分子的堆积, 从而防止荧光的淬灭. 在785 nm 激光激发下, H1 在CH2Cl2 中荧光量子产率达到2.0%, 表明该分子是一种优异的NIR-II 荧光探针. 经过进一步修饰, 得到三种具有良好生物相容性的SXH、SDH 和H1NPs 荧光探针: SXH 展现出优异的肾脏代谢能力, 可以被动靶向肿瘤部位实现恶性胶质瘤成像(图3f); SDH 可以通过主动靶向作用富集在肿瘤部位, 并可以通过肝胆和肾脏系统排出体外; 利用H1 NPs 实现了小鼠全身及肿瘤部位血管的成像, 并首次实现了NIR-II 荧光成像指导下小鼠前哨淋巴结切除手术. 乳腺癌是女性因癌症死亡的首要原因, 这主要归因于乳腺癌的早期症状相对隐蔽. 因此, 开发高量子产率NIR-II 荧光探针来实现乳腺癌早期、精准诊断意义重大. 2019 年, 肖玉玲课题组[17]制备出具有较强NIR-II 荧光发射的新型有机小分子H3,其在CH2Cl2 中荧光量子产率达到12.3%, 进一步PEG修饰得到H3-PEG2k. 该探针具有优异的水溶性、生物相容性、光稳定性、肾代谢能力及肿瘤被动靶向能力. 基于该探针, 作者首次实现了活体乳腺癌精准NIR-II 成像及成像指导的手术切除. 最近, 洪学传课题组[18]设计合成了对乳腺癌具有主动靶向能力的NIR-II 荧光探针CH1055-F3, 成功实现了移植和自发性乳腺癌高分辨特异性精准成像及活体自发性乳腺癌成像指导的手术切除, 为乳腺癌临床诊疗提供了重要指导方法.
图3
目前制备具有高荧光量子产率的NIR-II 探针已成为实现深层组织精准成像诊断的主要方法之一. 张晓东、梁永晔及戴宏杰等[19]以3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)为给体单元设计合成了IR-E1, 其中EDOT 的引入可以有效地减少共轭骨架与水分子等的相互作用, 达到提升荧光量子产率的效果(水溶液中达到0.7%). 利用探针高荧光特点, 实现了小鼠脑血管损伤的高分辨成像, 对研究创伤性脑损伤中血管病理特征提供了重要手段. 随后, 他们提出了一种新型荧光分子探针结构设计理论,即进一步引入电子屏蔽基团( S ) 设计合成具有S-D-A-D-S型荧光探针(图4a)[20].
图4
如在IR-FE中, 给电子单元EDOT 可减少探针与其它分子的相互作用, 屏蔽基团烷基链取代芴的引入可以进一步减弱分子间的相互作用从而降低聚集导致的荧光淬灭, 其在甲苯中的量子产率高达31%, 远远大于对照组IR-FT 及IR-BBE. 此外, 经聚乙二醇修饰后(即IR-FEP), 其水溶液中荧光量子产率仍可达到2%(图4b), 并成功用于活体肿瘤高信噪比、高分辨成像(图4c), 这项工作为研究荧光探针在水溶液中保持高量子产率提供重要思路. 在此基础上,他们进一步提出构筑S-D2-D1-A-D1-D2-S 型荧光探针(图5)[21]. 以连接屏蔽基团的噻吩作为第二供体(D2), 通过对连接受体的第一供体(D1)结构进行调控从而研究分子结构对荧光性能的影响. 结果表明, 由于辛烷噻吩的疏水性及位阻效果, 能够有效降低共轭骨架中心和水分子的相互作用, 导致IR-FTAP 具有很高的荧光量子产率(在水溶液中高达5.3%), 并成功用于小鼠下肢血管的高速NIR-II 荧光成像(＞25 帧/秒). 同时研究发现S-D-A-D-S 型荧光探针往往吸收系数较低, 从而影响生物成像效果. 基于此, 梁永晔、孙海涛及朱守俊等[22]以3,4-丙烯二氧噻吩(PDOT)作为给体基团、烷基链取代芴作为屏蔽基团设计合成新型NIR-II 荧光分子IR-FP8P,其在水溶液中峰吸收系数达到1.2×104 L•mol－1•cm－1,远远大于以往构筑的IR-FEP 探针(5.7×103 L•mol－1•cm－1)及IR-FTAP 探针(5.0×103 L•mol－1•cm－1), 同时其荧光亮度比IR-FEP 和IR-FTAP 探针提高了约3 倍以上,极大地提升了成像质量.
图5
尽管科学家们对如何设计探针分子结构实现高量子产率做了大量工作, 但大多荧光探针受到聚集诱导荧光淬灭(ACQ)效应的影响使其在水溶液或生理条件下荧光亮度降低, 严重限制了生物成像质量. 2001 年, 唐本忠等[23]发现了与ACQ 相反的一种奇特现象: 聚集诱导发光(AIE), 即处于聚集状态的探针荧光强度大大高于分散态, 其机理模型为分子内运动受限, 因此兼具AIE效应的NIR-II 荧光探针成像清晰度和分辨率会得到大幅提升. 2018 年, 刘斌和郑海荣等[24]以具有AIE 性质的四苯基乙烯单元作为供体设计合成新型NIR-II 荧光探针TB1(图6a), 其展现出优异的AIE 性能(图6b). 通过纳米共沉淀法制备得到纳米颗粒TB1 dots, 光谱性质表明, TB1 dots 最大荧光发射峰为975 nm, 且大部分位于NIR-II 区域, 其在水溶液中荧光量子产率高达6.2%, 远远高于常见的有机及无机NIR-II 荧光探针. 在TB1 dots上进一步修饰靶向基团c-RGD 多肽得到具有靶向功能的纳米粒子TB1-RGD dots, 成功实现脑胶质瘤高特异性、高信噪比及高分辨NIR-II 荧光成像. 2019 年, 洪学传课题组[25]以EDOT 作为给电子单元、四苯基乙烯衍生物作为AIE 单元设计合成新型小分子染料HLZ-BTED,进一步利用DSPE-PEG 对染料进行包覆获得具有良好水溶性和生物相容性的纳米粒子HLZ-BTED dots(图6c). 基于该纳米探针, 不仅可以实现肿瘤部位高分辨成像, 而且首次实现了不同状态下小鼠胃肠道NIR-II 成像, 成功区分出健康及肠梗阻状态下胃肠道蠕动差异,证明了具有AIE 效应的NIR-II 荧光探针可以作为胃肠道研究(如评估胃肠道运动功能障碍和评价药物对肠梗阻疗效)的有效工具, 进一步推进NIR-II 荧光成像技术在生物医学上的应用. 同年, 唐本忠和丁丹等[26]联合提出一种新型AIE 结构设计理念: 结构扭曲和螺旋形转子的组合, 制备得到了新型探针2TT-oC6B. 其最大发射峰值在1030 nm 处, 水溶液中量子产率高达11%. 利用对照分子证实了结构扭曲和螺旋形转子对提升探针荧光性质同等重要. 研究者进一步利用中性粒细胞作为载体携带2TT-oC6B(AIE@NE, 图7a)用于小鼠深层次脑炎NIR-II 荧光成像. 实验结果表明, 该探针可以有效穿越血脑屏障并选择性富集于炎症位置, 成功实现了深层次脑炎特异性成像, 信噪比高达30.6(图7b), 该研究极大拓展了AIE 材料在生物成像领域的应用潜力. 通过改变BBTD 上的单个原子, 谌小维、冯华和刘杰等[27]设计合成了新型具有AIE 特性的NIR-II 有机小分子BPST. S原子到Se 原子的改变使得受体单元吸电子能力增强,从而导致其吸收和发射光谱发生红移. 基于BPST 构筑的纳米粒子L897 NPs 具有良好的NIR-II 荧光性质, 量子产率可以达到5.8%, 实现了血管和淋巴的高分辨成像.
图6
图7
由于生物组织对NIR-IIa 及NIR-IIb 范围内的光子具有更低的吸收、散射和自发荧光, 因此, NIR-IIa 及NIR-IIb 荧光成像显示出巨大的应用潜力. 最近, 肖玉玲课题组[28]设计合成了具有较大扭转角的小分子染料HQL2, 其表现出优异的荧光性质及AIE 特征. 荧光光谱表明: HQL2 最大发射峰位于1050 nm, 并且可以延伸到1600 nm. 进一步利用两亲性分子DSPE-PEG5K 包覆HQL2 得到水溶性纳米颗粒HQL2 dots, 该纳米颗粒表现出良好的生物响应性、光稳定性及荧光性能(量子产率: 1.19% (＞1000 nm, IR-26 (0.05%)为参比), 0.016%(＞1300 nm), 0.002% (＞1550 nm)), 并成功用于小鼠血管和肿瘤组织高清晰NIR-IIa 及NIR-IIb 荧光成像. 该课题组进一步合成了具有高度扭曲及AIE 性质的NIR-II小分子HL3[29], 其在水中NIR-II 区域量子产率达到11.7% (＞1000 nm), NIR-IIb 区域达到0.05% (＞1550nm). 利用该AIE 探针首次实现了小鼠全身、脑血管和淋巴引流的1550 nm 以上的高分辨率生物成像, 为设计开发性能更加优异的NIR-IIb 荧光探针提供了模型. 唐本忠及钱骏等[30]于近期提出了一种新型分子结构设计理念, 即在分子和形态水平上操纵扭曲分子内电荷转移和聚集诱导发光效应对有机分子NIR-IIb 荧光成像进行探索( 图8). 设计合成了具有AIE 特性小分子2TT-oC26B 的荧光探针NIR-IIb NPs, 该探针发射范围可以达到1600 nm, 1000～1600 nm 范围内量子产率为11.5%, 1500～1600 nm 范围内量子产率为0.12%. 基于2TT-oC26B 的高荧光亮度性质, 成功实现小鼠血管和深部肠道的高清晰度和高信噪比NIR-IIb 荧光成像. 该研究提出的分子设计理论为有机NIR-IIb 荧光探针的发展提供重要启发.
图8
2.2 花菁类
花菁类染料是一类在两个氮杂环间以多个次亚甲基相连而成的分子, 通过改变中间区域次甲基链长度可以有效调解染料光学性质, 因此被广泛应用于生物成像领域. 2013 年, 戴宏杰等[3c]利用IR-1061 实现了小鼠内脏及血管NIR-II 荧光成像, 该研究也是首次利用有机小分子进行NIR-II 荧光成像. ICG 是一种被美国食品药品管理局FDA 批准的临床近红外染料, 具有优异的生物安全性, 在NIR-I 荧光成像领域具有重要的应用价值.近年来, 科学家们发现ICG 也能实现NIR-II 荧光成像,如2017 年, Starosolski 等[31]对ICG 的NIR-I 和NIR-II 荧光成像进行对比并成功实现小鼠后肢血管NIR-II 荧光成像(图9a). 2019 年, 程震和刘弘光等[32]首次构建了高性能的NIR-II 荧光内窥镜成像系统, 并利用ICG分子实现了小鼠大肠癌的成像检测. 最近, 程震、田捷和Gambhir 等[33]合作设计了可见光和近红外多光谱成像仪, 利用ICG光学性质首次实现了NIR-II 荧光成像指导的人体临床手术. 但ICG 存在稳定性差等缺陷, 其结构有待优化. 目前, 国内外已经报道了一系列新型花菁类NIR-II 小分子探针, 如2017 年, Sletten 等[34]用花色素盐代替ICG 的吲哚杂环得到了Flav 系列(Flav 1, Flav 3,Flav 5, Flav 7), 荧光发射波长可以从680 nm 到1045nm, 其中Flav 7 表现出最佳的荧光量子产率, 可用于小鼠体内深层血管的成像. 2018 年, 张凡课题组[35]设计合成了具有NIR-II 吸收和发射的有机小分子FD-1080, 与胎牛血清(FBS)结合后, 其荧光量子产率达到5.94%. 在1064 nm 激发下实现了具有高组织穿透深度和优异分辨率的NIR-II 成像, 进一步的实验证明FD-1080 探针能够监测清醒及麻醉状态下小鼠呼吸的动态情况. 相比于单体, J-聚集体的光物理性质有很大的不同, 如吸收/发射波长红移等, 因此J-聚集体在生物医学等方面具有重要应用潜力. 张凡课题组[36]利用1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)与FD-1080 间的自组装制备一种J-聚集纳米粒子(图9b), 使得最大吸收和最大发射值较FD-1080 单体红移了300 nm 左右, 且均超过1300 nm.另外, 该J-聚集纳米粒子在1500 nm 以上仍有较好的荧光发射, 基于此, 研究人员利用1500 nm 以上荧光成像的高信噪比、高分辨率等优点, 实现给药后高血压大鼠颈动脉血管的动态监测, 对临床降压药的体内疗效评估具有重要参考价值. 受ICG 聚甲炔骨架启发, 2019 年,洪学传课题组[37]设计合成了一种新型聚甲炔类有机小分子荧光染料5H5(图9c), 其具有较宽的光学吸收及荧光发射(最大吸收及发射峰分别为1069 nm 和1125 nm),因此可以同时实现808 nm 激发的NIR-II 成像及1064nm 激发的NIR-IIa 成像. 通过对小鼠血管及肿瘤成像表明, 相比于NIR-II 成像, NIR-IIa 成像具有更高的分辨率,其信噪比提高了3 倍, 该研究为有机小分子生物成像应用提供了新的选择.
图9
2.3 其它结构
除了以上两类分子, 科研人员也开发了其它结构的NIR-II 有机小分子荧光探针. 如2017 年, 杨有军课题组[38]设计并合成的以双苯并罗丹明为单元的新型荧光染料ECX 系列, 在880 nm 处均有较强的光学吸收, 最大发射波长均为915 nm 左右, 其中荧光量子产率最高可达13.3%, 且具有较好的化学稳定性和光稳定性等优势. 进一步利用染料实现了海拉细胞与活体小鼠成像,证实了ECX 染料在活体成像应用中的潜力. 2018 年, 我们课题组[39]设计构筑了一种J-聚集型方酸纳米粒子SQP-NPs(J), 其有效地提升了纳米粒子的NIR-II 荧光强度, 是H-聚集体纳米粒子SQP-NPs(H)的4.8 倍, 有效解决了探针荧光淬灭问题, 对肿瘤的精准诊断具有重要意义. 2019 年, 基于氮杂二吡咯亚甲基二氟化硼(Aza-BODIPY)结构, 我们课题组和李林课题组[40]合作设计合成了系列新型小分子探针, 该类探针具有较大的斯托克斯位移、优异的光稳定性, 且在水中具有较高的荧光亮度. 这些性质使其具备高分辨、深穿透的成像能力. 总之, 这些有机小分子探针极大促进了NIR-II 成像技术的发展, 在临床实用具有巨大潜力.
3 微环境激活型NIR-II 荧光成像探针
微环境是细胞间质液及其中各种成分的统称, 是细胞生存的必要条件. 微环境的稳定保证了细胞进行正常生命活动的场所, 其成分的异常会使细胞发生病变; 由于荧光成像依赖于目标-背景信号比值, 而现有的NIR-II 荧光探针大多为“always on”型, 即无论是否滞留在病变部位, 只要受到适宜波长的外部光源激发, 就会发出荧光信号. 这一性质会严重影响成像信噪比, 对手术及术后治疗产生不良影响[41]. 针对这一情况, 科学家们开发出了具有微环境特异性响应的可激活型荧光探针. 该类探针往往本身荧光较弱或者不产生荧光, 却可以通过与病变组织微环境中大量存在的某种分子反应来改变其分子结构, 从而获得发射明亮荧光的能力.与“always on”型NIR-II 荧光探针相比, 可激活型NIR-II荧光探针对生物组织具有特异靶向性、更高的成像信噪比和更低的检测限, 可以帮助医学工作者从分子水平来获取不同疾病的病理参数和体内病理机制, 从而优化治疗方案[42]. 本部分主要就针对不同疾病检测设计的可激活型NIR-II 有机小分子荧光探针进行介绍.
3.1 氧化还原激活
生物内环境氧化还原的动态平衡对维持生命十分重要, 这一平衡主要由氧化还原物种(主要分为活性氧物种ROS、活性硫物种RSS 和活性氮物种RNS)来调节[43]. 氧化还原在细胞中扮演着“双刃剑”的角色: 在健康组织中, ROS/RNS/RSS 等稳定地维持在正常范围内, 对新陈代谢至关重要[44]; 但细胞内外氧化还原物种的异常生成和积累, 则可能引发炎症、癌症等多种疾病[45]. 因此, 设计构筑氧化还原激活型NIR-II 荧光探针对重大疾病的检测及揭示相关作用机制等领域具有重要意义.
3.1.1 H2S 激活
2018 年的一项调查显示: 在36 种常见的癌症类型中, 结直肠癌(CRC)的发病率和死亡率分别高达10.2%和9.2%, 均位列前三甲[46], 因此设计开发针对CRC 的高效特异性诊断方法尤为重要. 研究表明CRC 组织中过表达的胱硫醚-β-合酶(Cbs)会促进硫化氢(H2S)的产生, 从而让肿瘤细胞生成能量, 并进行增殖、迁移和侵袭宿主[47]. 因此, 过量的H2S 可以作为CRC组织细胞的特异性识别位点. 在此背景下, 樊春海和赵春常等[48]设计合成了一个H2S 可激活型荧光染料ZX-NIR, 其最大吸收和发射峰分别位于520 nm 和600 nm, 在H2S 刺激响应下ZX-NIR 发生亲核取代反应, 即脱去4-硝基苯硫酚基团并由巯基取代, 从而产生具有NIR-I 光学吸收及NIR-II 荧光发射的NIR-II-HS. 研究人员将H2S 可激活型荧光染料ZX-NIR 和“always on”型NIR-I 染料共同包覆制备得到了一个比率型荧光探针, 成功实现了HCT116 肿瘤的特异性、高分辨率及深层次成像, 并成功实现了活体中HCT116 肿瘤与肝癌HepG2 肿瘤的检测与区分(图10a). 为了减少CRC 化疗的副作用, 实现CRC 的精准诊疗, 樊春海和赵春常等[49]进一步构筑了一种H2S 激活的纳米光热诊疗试剂(Nano-PT)用于CRC特异性NIR-II 荧光成像指导的光热治疗. 在正常组织环境下Nano-PT 是非功能性的, 但在富含H2S 的CRC 组织中可以被特异性激活, 从而产生NIR-II 荧光信号及光热效果. 利用Nano-PT 的特殊性质实现了活体HCT116肿瘤激活型NIR-II 荧光成像指导的激活型光热治疗, 有效地避免了探针非特异性和毒性问题, 为探索肿瘤标志物激活型诊疗研究提供了新的思路(图10b). 2019 年, 樊春海和赵春常等[50]继续围绕可激活探针展开研究, 开发了一种H2S 可激活的近红外光控药物释放纳米体系(图10c). 研究者们通过在热敏性材料中包覆药物盐酸伊立替康CPT-11 和H2S 激活型荧光探针InTBOD-Cl,制备了一种智能响应纳米材料NPs@BOD/CPT. 由于InTBOD-Cl 在NIR 区域没有吸收, 单独NIR 光照射下该纳米材料没有光热效应, 不能实现药物的可控释放. 但在富含H2S 的CRC 组织中, InTBOD-Cl 与H2S 反应生成具有强NIR-I 吸收的InTBOD-SH, 进一步经过NIR光照射, InTBOD-SH产生的光热效果导致热敏性材料发生相变, 从而达到药物在CRC 组织的可控释放. NIR 光照下,InTBOD-SH 也可以产生NIR-II 荧光, 实现CRC 高质量成像及成像指导的治疗. 该研究为可激活型成像及药物按需释放提供了理论模型.
图10
3.1.2 NO 激活
一氧化氮(NO)广泛存在于心血管、神经系统等多种生理系统中, NO 的表达量与炎症、癌症、组织损伤等多种疾病密切相关[51]. 另外, 研究表明NO 同时也是药物诱导肝毒性的重要标志物. 基于此, 2019 年, 我们课题组[52]报道了一种NO 激活的NIR-II 探针AOSNP(图11).在NO 存在的环境下时, 该探针原有的电子受体转变为更强的电子受体, 从而有效地将其荧光从NIR-I 区红移到NIR-II 区, 在NIR-II 区荧光量子产率达到0.35%, 表现出优异的荧光性能. 同时该探针具有特异性好、灵敏度高、响应迅速、检测限低、优越的肝脏富集能力、生物相容性和光稳定性好等性能, 成功用于体内原位、实时、无创NIR-II 荧光监测抗疼痛/发热药物对乙酰氨基酚APAP 剂量依赖性肝毒性. 该工作对多种疾病的产生和作用机制研究提供指导思路.
图11
3.1.3 •OH 激活
羟基自由基(•OH)是生物系统中氧化能力最强的分子之一, 与DNA、蛋白质和脂质等生物分子作用会造成严重的氧化应激损伤. 医学研究表明•OH 的浓度与各种生理过程和癌症、急性肝炎等病理过程密切相关. 刘志洪课题组[53]利用有机荧光团共轭体系和刚性平面结构的破坏和恢复策略开发了一种•OH 可激活型小分子NIR-II 荧光探针(图12), 首先设计合成了一种非平面、共轭性差的花菁类染料Hydro-1080, 其在可见光区域具较弱的光学吸收且没有荧光信号. 当Hydro-1080 被•OH 氧化生成Et-1080 后, 由于Et-1080 良好的共轭性和平面结构, 表现出优异的NIR-II 光学吸收及荧光发射. 实验结果表明, Hydro-1080 对体内的•OH 具有出色的灵敏度和选择性, 能够利用NIR-II 荧光成像技术示踪由外部刺激引起的肝脏内•OH 的细微变化, 实现了高对比度的体内成像, 该工作为激活型NIR-II 荧光探针的设计提供了新的策略.
图12
3.1.4 ONOO−激活
过氧亚硝酸阴离子(OONO−)通常由一氧化氮与超氧阴离子反应生成. 研究表明体内OONO−水平异常与慢性炎症、糖尿病及癌症等众多疾病相关. 另在药物诱导肝损伤过程会导致OONO−浓度升高. 2019 年, 张凡课题组[54]设计合成一例OONO−激活型有机小分子荧光探针IRBTP-B 用于APAP 诱导的肝中毒检测(图13a). 在IRBTP-B 结构中, OONO−响应单元苯硼酸酯的引入可以有效减少探针的共轭程度, 导致分子NIR-II 荧光淬灭;当OONO−与苯硼酸酯基团作用时, 分子内部发生氧化重排, 脱去4-亚甲基环己烯-1-酮分子, 生成具有较好共轭性质的IRBTP-B, 从而产生优异的NIR-II 荧光信号.结果表明, IRBTP-B 对OONO−具有高度特异选择性及较低的检测极限(55.9×10－9 mol/L), 通过对OONO−特异性NIR-II 荧光成像成功实现了对药物诱导肝损伤和N-乙酰半胱氨酸(NAC)对肝修复的实时监测. 随后, 张凡课题组[55]利用花菁类染料的波长可调性和呫吨染料的结构刚性, 设计合成了系列波长可调的NIR-II 荧光染料(CX). 体外实验证明, CX 染料在水溶液中具有较好的光稳定性和化学稳定性. 通过对CX 性质的深入探索,研究者将CX-1 和CX-3 共同包覆于纳米粒子中首次构筑了一例基于FRET 的OONO−特异响应比率型荧光探针PN1100, 即在OONO−刺激响应下, CX-1 位于920 nm处荧光发射峰逐渐增加, 而CX-3 位于1130 nm 处荧光发射峰逐渐降低. 基于比率型荧光探针的自校正性质,成功实现了药物诱导肝损伤的无创、精准成像检测, 为活体成像提供了新的方案(图13b).
图13
3.1.5 HClO/ClO−激活
生物体内的次氯酸/次氯酸根(HClO/ClO－)是在髓过氧化物酶催化双氧水和氯离子反应条件下生成的, 在生物体的主体防御(杀灭入侵的细菌、病毒等)中发挥重要作用. 然而, 次氯酸的过表达往往和诸多疾病密切相关,如神经炎症、肿瘤、心血管疾病及动脉粥样硬化等. 因此, 构筑高效、灵敏、特异性检测HClO/ClO−的探针至关重要[56]. 2018 年, 我们课题组[57]选择ClO−惰性的NIR-II 荧光半导体聚合物PDF 作为电子供体(D), 同时选择lO−敏感的有机小分子(ITTC)作为电子受体(A).利用两亲聚合物包封PDF 和ITTC 以形成纳米探针(SPNPs). 在非靶点组织, 纳米粒子内PDF 的NIR-II 荧光通过分子间D-A相互作用淬灭, 实现在非靶组织的荧光沉默. 当SPNPs 到达靶点部位后, 生物标志物ClO−特异性地降解ITTC, 有效地擦除了其受电子能力, 破除了D-A相互作用, 从而使PDF 的NIR-II 荧光恢复, 最终实现了炎症中ClO−的特异性成像(图14). 最近, 宋继彬和郭智勇等[58]设计合成了一例对HClO 具有快速、特异性响应的NIR-II 有机小分子荧光探针SeTT, 进一步修饰在下转换纳米颗粒DCNP 上获得了一种比率型纳米荧光探针. 利用该比率型荧光探针对HClO 浓度的线性相关性质, 成功实现了对肿瘤发展过程中及兔骨关节炎模型中HClO 浓度的实时可视化定量监测, 为生物标志物高灵敏、特异性检测及定量分析提供了新的工具.
图14
3.2 pH 激活
由于疾病组织中无氧代谢旺盛等因素, 导致其pH值与正常组织不同, 因此pH 值作为一种重要生理参数被广泛用于可激活型NIR-I 荧光成像设计, 但pH 激活型NIR-II 荧光成像研究却很少. 2019 年, 张凡课题组[59]设计合成新型花菁类NIR-II 有机小分子BTC1070, 该分子具有优异的光稳定性及荧光抗淬灭性, 其在水溶液中荧光亮度较传统染料提高了44 倍. 通过对探针光物理性质的研究发现, 该探针能通过响应pH 的变化而改变其荧光发射波长与强度, 实现了活体非侵入比率荧光成像和胃内pH值的定量测量, 且在4 mm深组织中的准确性可与标准pH 电极法相媲美(图15).
图15
3.3 乏氧环境NTR 酶激活
酶是一类重要的生物催化剂, 几乎参与了生物体所有的生理过程, 酶水平的异常会影响内环境稳态, 与多种疾病密切相关, 因此酶在开发可激活的荧光探针方面具有很大的前景. 乏氧作为肿瘤等多种疾病的常见特征之一[60], 能够使微环境中的硝基还原酶(NTR)过度表达,NTR 也被当作生物组织乏氧环境的标志物[61]. 2018 年,蔡林涛课题组[62]将硝基咪唑基团与NIR-II 染料IR-1048连接合成一例乏氧激活和NTR 酶响应的单分子探针IR1048-MZ. 由于电子转移作用力导致IR-1048 基团吸收降低及荧光淬灭, 因此IR1048-MZ 在正常组织部位没有光声/NIR-II 荧光信号及光热效果. 但肿瘤微环境内IR1048-MZ 可以被特异性还原为IR1048-MZH, 从而产生优异的光声/NIR-II 荧光信号及光热效果, 成功实现活体肿瘤高度特异性可激活NIR-II 荧光/光声成像指导的可激活光热治疗, 为炎症、中风和心脏缺血等其他相关疾病的成像和治疗提供了重要工具. 最近, 吴水珠和曾钫等[63]以二氢杂蒽为电子供体, 喹啉为电子受体,硝基苄氧基二苯胺为识别元件, 设计合成了一例新型荧光探针Q-NO2(图16), 该探针NIR-II 荧光处于“off”状态, 当与肿瘤乏氧微环境中硝基还原酶反应转变为Q-OH后, 实现NIR-II 荧光信号的逐渐恢复, 同时Q-OH具有AIE 效应, 进一步提升了NIR-II 荧光强度. 在两个乳腺癌小鼠模型中, 研究者利用探针优异的光学性质成功实现了乳腺癌连续转移过程的成像检测. 此外, 也可以利用多光谱光声断层成像(MSOT)对乳腺癌转移过程进行成像.
图16
3.4 黏度激活
作为生物微环境的重要标志之一, 黏度与许多生理病理学过程息息相关. 研究表明黏度水平的异常与众多疾病相关, 因此对黏度水平变化的监控对生命过程的理解十分重要. 最近, 刘志洪课题组[64]设计合成了一系列黏度激活的荧光探针WD-X, 由于存在分子转动导致WD-X 共轭程度降低及非辐射跃迁的增加, WD-X 表现出较弱的荧光信号; 环境黏度的增加可以有效地降低WD-X 中分子转动实现NIR-II 荧光强度的增加(图17).基于WD-X黏度激活型NIR-II 荧光性质, 研究人员首次实现糖尿病导致的肝损伤过程中的黏度变化监测.
图17
4 多模态成像
虽然NIR-II 荧光成像技术具有众多优势也取得了长足的进步, 但单一的成像方式往往存在一定的局限性, 难以同时提供生物过程的生理病理水平、功能代谢水平、解剖结构水平和分子细胞水平的信息[65]. 因此,结合多种成像技术的优点, 构筑基于NIR-II 荧光探针的多模态成像技术已成为当前生物医学成像领域的研究热点和难点.
4.1 多组分用于多模态成像
为了实现探针的多模态成像, 最常用的方式是将具有不同成像模式的材料组合起来(all-in-one), 以发挥其各自的作用[66]. 2018 年, 洪学传和程震等[67]通过碱催化的硫醇-丙炔酰胺双加成反应将放射性示踪剂68Ga、NIR-II 染料CH1055 及RGD 多肽相结合, 制备得到αvβ3靶向的NIR-II 荧光/正电子发射型计算机断层显像(PET)双模态成像探针68Ga-SCH2, 其具有较好的生物相容性、肿瘤靶向性及代谢性能. 研究者利用两种成像模式的优点成功实现U87MG 肿瘤的精准成像及轮廓的精准确证, 并成功实现了肿瘤的精准切除, 证明了该双模态成像方式在临床手术中具有巨大的应用潜力. 2019 年,程震等[68]利用自下而上的策略, 通过集成多层次仿生纳米材料开发了一种杂化纳米平台. 该平台可以有效负载NIR-II 染料CH-4T 和放射性的核素64Cu, 且具有粒径大小可调、稳定性高及分散性好等优点. 通过对比实验, 发现这种多层纳米结构能使染料的NIR-II 荧光亮度显著增强. 进一步使用该探针实现了肿瘤NIR-II 荧光/PET 成像检测及肿瘤切除手术的成像引导(图18). 同年,洪学传课题组[69]利用乳铁蛋白(Lf)与锰离子复合制备Mn2+-Apo-Lf-PEG 纳米平台, 通过进一步修饰NIR-II 荧光探针CH1055, 构建了具有NIR-II 荧光成像/核磁共振成像(MRI)的纳米探针(H-dot). 实验表明H-dot 具有低毒性、良好的稳定性与生物相容性. 利用H-dot 优异的NIR-II 荧光/T1 加权MRI 成像能力, 成功实现了皮下/原位U87MG 胶质母细胞瘤的高特异性和高对比度成像检测.
4.2 单组分用于多模态成像
虽然all-in-one 方法可以简单有效得到多模态成像探针, 但该方法面临可重复性差、组成复杂等缺点, 限制了其临床转化. 另一种方法是构建单一分子使其同时具有多种成像功能(one-for-all)[70], 具有结构简单、组分单一、可重复性好等优点, 表现出良好的临床转化前景.2017 年, 程震等[71]利用磷脂对BBTD 类NIR-II 荧光染料进行包覆制备得到纳米粒子DAPs, 进一步在DAPs表面修饰EGFR Affibody(Ac-Cys-ZEGFR:1907)制备得到具有肿瘤靶向性能的多功能纳米荧光探针Affibody-DAP(图19a). 该纳米探针具有良好的单分散性、优异的NIR-I 光学吸收及NIR-II 荧光发射(量子产率达到11.1%), 在FTC-133 皮下小鼠肿瘤模型中展现出较高的光声和NIR-II 荧光信号, 实现了单一波长激发下肿瘤靶向NIR-II 荧光/光声成像(图19b 和19c). 2019 年,孙耀课题组[72]基于BBTD 结构设计合成了DD-A-DD 型荧光探针SYL(图20), 相比于传统的D-A-D 型探针, 由于第二供体的引入增加了分子电子密度和摩尔消光系数, 使得SYL 具有优异的荧光性能. 自组装得到的SYLNPs 的最大发射波长峰值为976 nm 处. 经尾静脉注射,SYL NPs 可有效地被动靶向肿瘤部位, 并成功实现活体肿瘤高信噪比NIR-II 荧光/光声成像. 同年, 该课题组[73]制备了新型荧光探针SY1080, 其发射波长峰值达到1080 nm. SY1080 在活体中表现出与SYL 类似的NIR-II 荧光/光声成像能力. 此外, 我们课题组[74]也成功构筑了一例有机小分子成功实现单一波长激光激发下的活体肿瘤NIR-II 荧光/光声成像, 进一步拓展了NIR-II 有机小分子在生物医学领域的应用潜力. 2019 年,唐本忠和丁丹等[75]通过优化分子结构和调节分子内运动, 设计合成了同时具有最优NIR-II 荧光、光声及拉曼信号的AIE 分子OPTA-TQ3. 基于该探针的优势, 成功实现肿瘤切除手术中不同阶段的精准成像检测, 在成像介导的手术领域具有潜在的应用前景.
图20
5 NIR-II 荧光成像指导的光学治疗
尽管化疗是临床肿瘤治疗的主要选择之一, 但其存在非特异性及副作用大等缺点[76]. 近年来, 光学治疗(主要包括光热治疗PTT 及光动力治疗PDT)作为新型无毒的治疗手段而受到人们广泛的关注[77]. 光热治疗主要是利用光热试剂将光能转化为热能从而杀死肿瘤细胞[78]; 对于光动力治疗, 肿瘤细胞主要是被光敏剂产生的单线态氧(1O2)或其他活性氧(ROS)杀死[79]. 在近红外激光照射下, NIR-II 荧光探针不仅可以发射NIR-II 荧光信号, 而且可以产生热能等对病变组织进行灭杀, 实现诊疗一体化效果, 进一步展示了NIR-II 荧光探针的应用前景.
5.1 成像指导的PTT
2018 年, 洪学传课题组[80]对以前报道的BBTD 类材料进行修饰得到末端为磺酸基团的探针H2a-4T. 探针分子与胎牛血清蛋白(FBS)复合后可以显著提升NIR-II 荧光强度, 实现小鼠淋巴结、淋巴管的实时示踪及成像指导的前哨淋巴结切除手术. 此外, 将探针与肿瘤抗体药物-西妥昔单抗混合形成H2a-4T@Cetuximab复合物, 该复合物具有优异的靶向性能及光热转换效率, 成功用于具有免疫缺陷的荷结肠瘤裸鼠NIR-II 荧光成像引导的靶向光热治疗. 这也是首例NIR-II 染料与生物蛋白结合的NIR-II 光热制剂, 对未来肿瘤临床治疗意义重大. 此外, 唐本忠和钱骏等[81]开发了一种单组分诊疗纳米粒子BPN-BBTD NPs, 该纳米粒子具有优异的稳定性、生物相容性、NIR-II 荧光性能(量子产率1.8%)及光热转变效率(39.8%). 利用高分辨率NIR-II 荧光图像清楚地证实了BPN-BBTD NPs 对皮下和原位肿瘤具有高效靶向能力; 基于NIR-II 荧光成像引导下的光热治疗可以彻底根治皮下肿瘤且不再复发, 并可以有效抑制原位肿瘤的生长. 同时由于具有高保留性能及稳定性,BPN-BBTD NPs 能够实现皮下和原位肿瘤的长期监测(32 d), 这种具有单组分诊疗效果及长期监测能力的纳米体系的开发为肿瘤高效、安全治疗提供了新的平台(图21a).
2019 年, 王强斌和闫立峰等[82]将NIR-II 荧光材料Flav7 与两亲性多肽结合构筑了一种肿瘤靶向探针PFNPs. 研究表明PF NPs 具有显著的光热转化效率(42.3%)、优异的光热稳定性、可忽略的细胞毒性、优异体内血液循环时间和肿瘤部位富集, 成功用于活体肿瘤NIR-II 荧光成像指导的靶向光热治疗(图21b). 陆伟和肖泽宇等[83]利用人血清白蛋白(HSA)与基于BBTD 的AIE小分子相结合从而限制其分子内的转动来调节荧光和光热效率, 并实现肿瘤区域特异性地递送和富集. 利用该荧光染料在术中高分辨NIR-II 荧光成像的引导, 研究者能够清晰观察到小鼠体内0.5 mm×0.3 mm 微小转移肿瘤; 进一步利用荧光成像确定探针的空间分布及优化激光参数, 成功实现了术中对微小肿瘤的精准光热清除, 为微小肿瘤治疗提供了新方案. 最近, 汪登斌和张兵波等[84]设计合成了基于方酸结构的D-A-D 型NIR-II有机小分子SQ1, 其最大吸收及发射峰分别位于930 和970 nm 处. 研究者首先利用纳米沉淀法构筑水溶性纳米颗粒SQ1@DSPE, 进一步修饰多肽CREKA构筑具有肿瘤靶向性能的纳米探针, 并成功用于转移性乳腺癌(特别是肺转移)的NIR-II 荧光/光声双模态成像. 借助SQ1 出色的光热转换能力, 在915 nm 激光激发下可实现对肿瘤的光热治疗, 该工作为转移性乳腺癌诊疗提供新的研究思路(图21c)
图21
5.2 成像指导的联合治疗
尽管目前光学治疗技术得到了较大的提高, 但单一治疗方式很难达到理想的治疗效果[85], 开发新型纳米体系用于NIR-II 荧光成像指导的肿瘤联合治疗是十分迫切的. 2019 年, 我们课题组[86]构筑了一例新型光学诊疗平台, 实现了单一波长激光触发的NIR-II 荧光/光声双模态成像指导的PTT/PDT/化疗联合治疗. 首先设计合成了新型有机小分子NIR-II 染料DPP-BT, 该染料可以同时作为NIR-II 荧光/光声双模态成像造影剂及PTT/PDT 联合治疗试剂; 其次利用热敏性材料实现DPP-BT 及化疗药物DOX 的高效负载得到新型光学纳米诊疗粒子P(DPP-BT/DOX) NPs. 在单一波长近红外激光照射下, P(DPP-BT/DOX) NPs 具有优异的NIR-II 荧光/光声成像能力及良好的PTT/PDT 联合治疗效果. 同时, 由于DPP-BT 产生的光热效果使得P(DPP-BT/DOX)NPs 进一步发生相变, 导致DOX 释放从而实现化疗的效果. 该智能响应性多功能诊疗体系的设计开发为癌症诊疗领域研究提供了有效的理论依据(图22). 最近, 我们课题组[87]利用三苯基膦修饰的两亲性聚合物对引达省并二噻吩并吡咯类有机半导体材料进行包覆, 得到具有线粒体靶向性能的水溶性纳米粒子T-IPIC NPs. 在808 nm 激光照射下, T-IPIC NPs 具有良好的NIR-II 荧光量子产率、光热转化系数及单线态氧产率. 活体实验表明T-IPIC NPs 具有优异的肿瘤诊疗性能. 值得注意的是, 在整个治疗过程中仅仅注射了一次T-IPIC NPs 及一次808 nm 激光照射. 该高效光学诊疗体系的构筑为癌症高效、安全治疗提供了丰富的思路.
图22
6 结论与展望
本综述主要总结了近年来NIR-II 有机小分子荧光探针领域的研究进展, 主要包括新型NIR-II 有机小分子荧光探针分子结构设计、荧光探针量子产率提高策略、可活型NIR-II 荧光探针、多模态成像探针及诊疗一体化探针. 这些研究表明基于有机小分子的NIR-II 荧光探针在重大疾病的诊断与治疗等领域表现出优异的效果,具有潜在的临床应用价值.
尽管NIR-II 有机小分子荧光探针已取得较大发展,但仍存在进一步研究空间: (1) 目前构筑的NIR-II 有机小分子荧光探针激发波长大多为NIR-I 区域, 对于安全性更高、穿透深度更深的NIR-II 激光利用较少, NIR-II激光激发的探针有待进一步开发; (2) NIR-IIb 荧光成像极大地提高了诊断结果, 但已开发的探针大多为荧光发射尾部延伸至NIR-IIb 区域, 开发发射主峰位于NIR-IIb区域的荧光探针是研究的重要方向之一; (3) 为进一步提高探针生物相容性及代谢能力, 设计合成可降解的有机小分子荧光探针是未来发展的热点与难点之一; (4)NIR-II 荧光探针与其它动物(如兔子和猴子)生物系统的相互作用仍需要进一步探索, 以获得长期生物安全、免疫反应和药代动力学等更为全面的动物研究结果, 为临床实际应用提供重要支撑.
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10、动物载物台具有加温保暖功能；
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适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。
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